Hemoglobinelektroforeseeksperiment

Eksperimentprinsipp

Hemoglobinelektroforese tar sikte på å oppdage og bekrefte ulike normale og unormale hemoglobiner.

På grunn av de forskjellige ladningene og isoelektriske punktene til forskjellige hemoglobintyper, i en viss pH-bufferløsning, når det isoelektriske punktet til hemoglobin er lavere enn pH-verdien til bufferløsningen, bærer hemoglobin en negativ ladning og migrerer mot anoden under elektroforese. Motsatt beveger hemoglobin med positiv ladning seg mot katoden.

Under en viss spenning og etter en spesifikk elektroforesetid, viser hemoglobiner med forskjellige ladninger og molekylvekter forskjellige migrasjonsretninger og -hastigheter. Dette gir mulighet for separasjon av distinkte soner, og påfølgende kolorimetrisk eller elektroforetisk skanningsanalyse kan utføres på disse sonene for å kvantifisere ulike hemoglobiner. Den mest brukte metoden er pH 8,6 celluloseacetatmembranelektroforese.

Innenfor cytoplasmaet oksideres etylenglykolgrupper (CHOH-CHOH) som finnes i glykogen eller polysakkaridstoffer (som mukopolysakkarider, mukoproteiner, glykoproteiner, glykolipider, etc.) av perjodsyre og omdannes til aldehydgrupper (CHO-CHO). Disse aldehydgruppene kombineres med det fargeløse lilla-røde Schiff-reagenset, og danner et lilla-rødt fargestoff som avsettes der polysakkarider er tilstede i cellen. Denne reaksjonen er kjent som periodisk syre-Schiff (PAS) farging, tidligere referert til som glykogenfarging.

Eksperimentmetode

Materialer:Celluloseacetatmembrane, elektroforeseapparater(DYCP-38C og strømforsyning DYY-6C ), Overlegen prøveinnlastingsverktøy (pipette), spektrofotometer, kolorimetriske kyvetter, buffere.

Buffer:

(1) pH 8,6 TEB-buffer: Vei 10,29 g Tris, 0,6 g EDTA, 3,2 g borsyre, og tilsett destillert vann til 1000 ml.

(2) Boratbuffer: Vei 6,87 g boraks og 5,56 g borsyre, og tilsett destillert vann til 1000 ml.

Prosedyre:

Preparasjon av hemoglobinløsning

Ta 3 ml blod som inneholder heparin eller natriumcitrat som antikoagulant. Sentrifuger ved 2000 rpm i 10 minutter og kast plasmaet. Vask de røde blodcellene tre ganger med fysiologisk saltvann (750 rpm, 5 minutter sentrifugering hver gang). Sentrifuger ved 2200 rpm i 10 minutter og kast supernatanten. Tilsett en lik mengde destillert vann, og tilsett deretter 0,5 ganger volumet av karbontetraklorid. Rist kraftig i 5 minutter, og sentrifuger deretter ved 2200 rpm i 10 minutter for å samle opp den øvre Hb-løsningen for senere bruk.

Bløtlegging av membranen

Skjær celluloseacetatmembranen i strimler som måler 3 cm × 8 cm. Bløtlegg dem i pH 8,6 TEB-buffer til de er helt mette, fjern deretter og tørk med filterpapir.

Spotting

Bruk en pipette til å se 10 μl av hemoglobinløsningen vertikalt på celluloseacetatmembranen (den grove siden), ca. 1,5 cm fra kanten.

Elektroforese

Hell boratbufferløsningen inn i elektroforesekammeret. Plasser celluloseacetatmembranen med den flekkete siden ved katodeenden av kammeret. Kjør på 200 V i 30 minutter.

Eluering

Skjær ut HbA- og HbA2-sonene, plasser dem i separate reagensglass, og tilsett henholdsvis 15 ml og 3 ml destillert vann. Rist forsiktig for å eluere hemoglobinet fullstendig, og bland deretter.

Kolorimetri

Nullstill absorbansen med destillert vann for elueringsløsningen og mål absorbansen ved 415 nm.

Beregning

HbA2(%) = Absorbans av HbA2-rør / (Absorbans av HbA-rør × 5 + Absorbans av HbA2-rør) × 100 %

Eksperimentell resultatberegning

Referanseområde for pH 8,6 TEB-buffer Celluloseacetatelektroforese: HbA > 95 %, HbA2 1 %-3,1 %

Notater

Elektroforesetiden bør ikke være for lang. Celluloseacetatmembranen skal ikke tørke ut under elektroforese. Stopp elektroforese når HbA og HbA2 er tydelig atskilt. Langvarig elektroforese kan forårsake bånddiffusjon og uskarphet.

Unngå å bruke for mye prøve. For mye hemoglobinvæske kan føre til båndløsning eller utilstrekkelig farging, noe som resulterer i falskt forhøyede HbA-nivåer.

Forhindre kontaminering av celluloseacetatmembranen med proteiner.

Strømmen bør ikke være for høy; ellers kan det hende at hemoglobinbånd ikke skilles.

Inkluder alltid prøver fra normale individer og nødvendige kjente unormale hemoglobiner som kontroller.

Beijing Liuyi Biotechnology produserer den profesjonelle elektroforesetanken for hemoglobinelektroforese som er modellenDYCP-38Ccelluloseacetatmembranelektroforesetank, og det er to modeller av elektroforesestrømforsyning tilgjengelig for celluloseacetatmembranelektroforesetankenDYY-2CogDYY-6Cstrømforsyning.

I mellomtiden tilbyr Beijing Liuyi Biotechnology celluloseacetatmembran til kunder, og størrelsen på celluloseacetatmembran kan tilpasses. Velkommen til å spørre oss om prøver og mer informasjon.

Beijing Liuyi-merket har mer enn 50-års historie i Kina, og selskapet kan tilby stabile og høykvalitetsprodukter over hele verden. Gjennom år med utvikling, er det verdig ditt valg!

Vi ser nå etter partnere, både OEM elektroforesetank og distributører er velkommen.

Hvis du har en kjøpsplan for produktene våre, ikke nøl med å kontakte oss. Du kan sende oss melding på e-post[e-postbeskyttet]eller[e-postbeskyttet], eller vennligst ring oss på +86 15810650221 eller legg til Whatsapp +86 15810650221, eller Wechat: 15810650221